单细胞技术使人们对肿瘤微环境的表征研究达到了前所未有的深度。然而，许多单细胞研究缺乏空间环境。研究者应用成像型质谱流式细胞分析（IMC）研究了139例高级别胶质瘤46例脑转移瘤的免疫学特征。

通过对389张高维组织病理学图像中110多万个细胞的单细胞分析，实现了免疫谱系和激活状态的空间分辨率，揭示了原发性肿瘤和不同实体肿瘤脑转移之间的免疫景观差异。

这些分析揭示了与胶质母细胞瘤患者生存相关的细胞邻域，研究者利用这些细胞邻域来鉴定与长期生存相关的髓过氧化物酶（MPO）阳性巨噬细胞的独特群体。

研究背景

最常见的脑肿瘤类型包括胶质母细胞瘤和脑转移瘤。除手术外，靶向肿瘤细胞的细胞毒性疗法通常是治疗的第一道防线，但是，超过2年的存活率仍很少见。

肿瘤微环境（TME）是肿瘤进展的主要调节器，脑的TME具有独特的成分，除外浸润的淋巴细胞，主要由功能多样的星形胶质细胞和致瘤前巨噬细胞组成。目前还没有研究使用高度复性的组织学对脑TME生态位内的单个细胞进行空间表征。因此，研究者使用了成像型质谱流式细胞技术（IMC）来表征胶质母细胞瘤和脑转移瘤的TME，并探索空间分辨特征与临床预后的关系。

利用IMC绘制脑肿瘤微环境景观图

研究者采集了389张高维组织病理学图像，代表139个高级别胶质瘤和46个脑转移瘤患者肿瘤（图1a，b）。胶质瘤包括手术期间获得的切除组织（共270张图像，192张来自原发性胶质母细胞瘤），包括长期存活者（78张图像）。脑转移瘤图像来源于多种原发性恶性肿瘤。将图像分割成1163362个总细胞，对肿瘤细胞、星形胶质细胞、血管和16个以上免疫细胞群体进行分类（图1c）。在所有组织的间质中，主要细胞群包括GFAP+星形胶质细胞和CD68+巨噬细胞，而淋巴细胞相对较少（图1d，e）。

P2Y12的表达将组织驻留的小胶质细胞与单核细胞衍生的巨噬细胞区分开来，CD163的表达将推定的M2样细胞与M1样细胞区分开来（图1c）。巨噬细胞和小胶质细胞是所有样本中的主要免疫群体，分别占TME的30.5%和9.2%（图1d）。

图1a、 应用于胶质瘤和BrM组织微阵列的IMC管道示意图。对样品进行多重染色，并使用细胞术通过飞行时间（CyTOF）获取数据。在空间分析之前进行细胞分割和谱系分配。c、 热图显示了细胞亚群相关IMC标志物表达水平。d、 根据临床亚组，所示细胞类型占TME内所有细胞百分比的堆积条形图。e、按组织类型分类的TME中细胞群占所有细胞百分比的分布。

单细胞相互作用网络

研究者将每种细胞类型的频率量化为每幅图像中细胞总数的百分比，并比较了患者的临床相关亚组（图2a、b），评估了每个图像区域内的细胞密度。相邻正常组织中大多数细胞类型的频率都有所增加（图2a），而细胞密度减少。在IDH野生型（胶质母细胞瘤）与IDH突变型（IV级星形细胞瘤）肿瘤中，NK细胞的频率降低（图2a） 。此外，胶质母细胞瘤肿瘤中CD16+（细胞毒性）的比例低于CD16-（未成熟）NK细胞亚群。IDH野生型与突变型肿瘤相比，巨噬细胞（而非小胶质细胞）的招募频率和密度更高（图2a），这表明巨噬细胞的外周招募增强，病变严重程度更高。

通过MGMT甲基化状态分析胶质母细胞瘤样本，发现了最小的免疫学差异；然而，按生存时间细分显示，与短期存活者（STS）（总生存低于一年）相比，长期存活者（LTS）（总生存期超过三年）肿瘤的内皮细胞频率更高（图2a），这可能与化疗有关。与STS肿瘤相比，LTS肿瘤的CD8−CD4−T细胞和M1样巨噬细胞聚集的频率更高，M2样巨噬细胞没有差异（图2a）。在胶质母细胞瘤临床亚组中，根据频率和密度观察到非常少的淋巴细胞（图2b），支持胶质母细胞瘤是对免疫检查点阻断反应较差。

然而，胶质母细胞瘤图像的子集显示出异常高的T细胞频率（TME中超过5%的细胞）。这些样本富集了CD8+、CD4+和CD8−CD4−T细胞亚群，但没有免疫抑制性Treg细胞，与T细胞数量较少的样本（TME中少于5%的细胞）相比，平均生存时间增加了62%。最后，研究者观察到男性患者肿瘤中外周源单核细胞的频率高于女性患者，这与内皮细胞的频率较高一致（图2a）。

研究者还检查了脑转移瘤样本的免疫细胞动力学。与胶质母细胞瘤相比，NK细胞（尤其是CD16+15）、中性粒细胞、巨噬细胞、经典单核细胞和T细胞（包括Treg细胞）的频率和密度增加，树突状细胞和非经典单核核细胞减少（图2a）。在观察脑转移瘤核心中与脑转移瘤进展相关的免疫学变化时，研究者发现，在没有软脑膜疾病（图2a）或局部复发（超过724天后）的患者中，单核细胞和小胶质细胞增加，这表明这些细胞可能具有保护作用。黑色素瘤脑转移瘤富集了单核细胞和小胶质细胞，并在肿瘤边缘显示出CD8+T细胞的显著积累（图2a）。与胶质母细胞瘤不同，脑转移瘤在免疫检查点阻断尤其是黑色素瘤脑转移瘤中表现出一定的脆弱性。在脑转移瘤核心，男性患者的CD8+T细胞更多；年轻患者的中性粒细胞、树突状细胞和CD4+T细胞更多（图2a）。

研究者使用排列测试来查询脑肿瘤的位置结构，以量化细胞-细胞共定位，并识别细胞对之间的相互作用或回避行为（图2c）。与胶质母细胞瘤相比，脑转移瘤中的肿瘤细胞更有可能避免TME中的大多数非癌谱系（图2c），这表明脑转移瘤中肿瘤细胞的拓扑结构相对于胶质母细胞瘤的分散性更紧密，与观察到的同型细胞相互作用模式一致（图2c）。与胶质母细胞瘤相比，脑转移瘤中的整体异型细胞相互作用增加（图2c），这表明胶质母细胞细胞瘤和脑转移瘤与周围脑实质接触的方式根本不同，尽管共享一个共同的组织生态位。

在胶质母细胞瘤和脑转移瘤中，脉管系统是脑TME的关键组成部分；例如，血管周围生态位维持胶质瘤起始细胞池，血脑屏障（BBB）调节脑转移瘤的传播。鉴于对LTS肿瘤内皮细胞富集的观察（图2a），检查了胶质母细胞瘤血管生态位内的细胞动力学。内皮细胞很可能与星形胶质细胞相互作用，这对BBB功能至关重要（图2c）。内皮细胞也与肿瘤细胞表现出强烈的相互作用（图2c）；血管周围肿瘤细胞的Ki67:CC3比率降低（图2d），这表明直接接触血管可能会阻碍肿瘤细胞的扩张。

巨噬细胞也显示出与胶质母细胞瘤中的内皮细胞相互作用的强烈趋势（图2c）。这些相互作用在空间上是协调的。与避免直接内皮相互作用的细胞相比，巨噬细胞与内皮结合时显示出较低的Ki67:CC3比率（图2e），概括了增殖的脑巨噬细胞与胶质瘤进展之间的关系。而T细胞与内皮细胞或巨噬细胞相互作用的趋势不大（图2c）。当检查血管邻近度时，血管周围M1样巨噬细胞显示出比远离血管的巨噬细胞更高的CD40表达，血管周围M2样巨噬细胞表达高水平的OX40L。总之，这些数据暗示了血管微生态的存在——巨噬细胞可能为T细胞和肿瘤细胞的扩张提供有益的信号线索，并支持血管在形成脑TME环境中的作用。

研究者接下来探讨了脑转移瘤中的血管相互作用。与胶质母细胞瘤类似，内皮细胞很容易与脑转移瘤中的肿瘤细胞相互作用（图2c）。在脑转移瘤-核心和脑转移瘤-边缘内，与肿瘤细胞相关的内皮细胞显示Ki67表达增加（图2f、g）。内皮细胞增殖似乎通过与CD8+T细胞的相互作用而受到抑制，这种作用对脑转移瘤核心具有特异性（图2h）。值得注意的是，与脑转移瘤血管通透性相关的血脑屏障中claudin-5紧密连接蛋白的表达受到空间调节。在脑转移瘤核心（但不是脑转移瘤边缘）内，癌旁内皮细胞与回避的内皮细胞相比，claudin-5表达较低。与肿瘤细胞相关的内皮细胞在BrMs中显示claudin-5减少，并伴有中高程度的瘤周水肿；而在BrMs中，无或低瘤周水肿。这些数据显示了血脑屏障完整性和转移之间的空间分辨联系，以及它与血管增殖和水肿的关系。

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图2a、 患者临床亚组之间的细胞频率比较。b、 T细胞频率占临床亚组总细胞的百分比。c、 成对相互作用热图。d，e、 Ki67:CC3比率。f,g,h、内皮细胞中Ki67的表达。

空间细胞邻域

研究者还探讨了肿瘤内的多细胞结构是否能为脑TME动力学的组织和预后提供指导。两个变量影响细胞邻域评估：邻域内相互作用细胞的数量（N）和总细胞邻域的数量（CN）。胶质母细胞瘤和脑转移瘤图像中识别了9个CN（图3a，b）。CNs的细胞组成概括了已知的组织特征，包括肿瘤边界（CN1）或肿瘤成分（CN8）、两个泛免疫热点（CN2）或选择亚群的缺陷（CN9）、高（CN3）或低（CN4）星形胶质细胞、血管生态位（CN6）、巨噬细胞（CN7），以及未定义的邻域（CN5）（图3b）。胶质母细胞瘤主要为CN3和CN4（星形胶质细胞），而脑转移瘤核心富集CN8（肿瘤成分），反映了与转移性肿瘤相比胶质瘤的浸润性（图3c）。

研究者比较了给定肿瘤样本中代表每个CN的细胞比例，发现LTS肿瘤中巨噬细胞富集CN7的表达明显高于STS肿瘤（图3d）。此外， CN7与改善生存率之间的关联（图3e）。富含M1样巨噬细胞的CNs与延长的生存期相关。值得注意的是，CN2和CN9（泛免疫热点）也与提高生存率相关（图3e）；与STS肿瘤相比，LTS肿瘤中CD4+T细胞的数量增加，其在CN2和CN9中都富集（图3b）。这些数据表明，尽管T细胞在胶质母细胞瘤中的水平很低，但T细胞邻近区可能会发挥有益的作用。

研究者关注CN7在胶质母细胞瘤中的预后相关性， 因为CN7与生存的相关性最为一致。与STS肿瘤相比，LTS肿瘤中细胞簇（CL）1-3显著富集（图3g），其中大多数是CD163−P2Y12−，提示M1样巨噬细胞表型（图3h）。然而，它们共表达CD206，表明这些细胞不遵循M1/M2模式，不像其他富含CD163+细胞的高CD206簇（例如CL11–15；图3h）。在比较CL1–3在每个CN中的相对表达（图3b）时，研究者观察到CN7的富集，特别是在LTS肿瘤患者中（图3i）。总之，巨噬细胞的空间关系可能包含重要的预后信息。

图3a、 细胞邻域（CN）分配示意图。b、 在胶质母细胞瘤和BrM核心中发现的9个CN中代表的细胞类型的热图。c、 CNs在胶质母细胞瘤中的分布。d–i，LTS对照胶质母细胞瘤队列分析（总生存率 >3年）和STS（总生存率 <1年）。d、 LTS和STS胶质母细胞瘤队列中CNs的分布。e、基于CN中值频率的LTS和STS胶质母细胞瘤队列的Kaplan–Meier分析。f、所有胶质母细胞瘤图像中巨噬细胞和单核细胞的t-SNE无监督聚类。g、 胶质母细胞瘤患者单核细胞和巨噬细胞的t-SNE投射。h、 功能标志物的相对表达（左）和15个单核细胞和巨噬细胞簇中细胞类型的分布（右）（CL1–15）。i、 在LTS和STS胶质母细胞瘤队列中每个细胞邻域中发现的CL1-3细胞数量。

MPO+巨噬细胞与生存相关

CL1–3巨噬细胞表达了高水平的MPO （图4a）， 超过80%的MPO+巨噬细胞为CD163−P2Y12−，表明由外周来源的巨噬细胞主导的促炎表型。免疫荧光确认了胶质母细胞瘤中MPO+IBA1+巨噬细胞的存在（图4b）。研究者观察到与活性氧物种生物合成和吞噬体形成（表明细胞毒性）以及HIF1α信号（表明与血管的距离）相关的特征（图4c）。MPO+巨噬细胞不太可能与内皮细胞相互作用，这与CL1-3中富集的HIF1α一致（图4d）。研究者还发现LXR–RXR信号传导减少（图4c）。这些数据表明，MPO+巨噬细胞可能具有抗肿瘤特性。

MPO+巨噬细胞数量的增加与中性粒细胞总数、M1样巨噬细胞和经典单核细胞的增加相对应（图4e）。CN7和CN2（图4f）都为患者提供了显著的生存益处（图3e）。随着MPO+巨噬细胞密度的增加，肿瘤细胞更倾向于回避中性粒细胞和M1样巨噬细胞（图4g）。随着MPO+巨噬细胞密度的增加，大多数髓系细胞群体回避中性粒细胞，M1样巨噬细胞除外（图4g）。MPO+巨噬细胞密度较高还与内皮细胞和M1样巨噬细胞与T细胞之间的相互作用增加有关，同时M2样MDMs和CD8+T细胞之间相互作用减少（图4g），这可能在癌症中起免疫调节作用。巨噬细胞之间的关联增加，而对小胶质细胞的关联相对较少（图4g）。

最后，胶质母细胞瘤队列证实了MPO+CD163−P2Y12−CD68+巨噬细胞水平的增加与生存期延长相关。与STS或LTS肿瘤相比，复发性胶质母细胞瘤含有更少的MPO+CD163−P2Y12−CD68+巨噬细胞。由于MPO+巨噬细胞的绝大多数（83.96%）是CD163−和P2Y12−，MPO与IBA1的组合足以证实双阳性细胞频率高的患者的生存期显著延长（图4h）。这表明，广泛靶向胶质母细胞瘤中巨噬细胞的治疗可能会耗尽有益的巨噬细胞亚群，这为CSF-1R抑制剂的临床试验增加了洞察力，并加深了对巨噬细胞复杂性的理解。

图4a、 MPO表达的热图投影到胶质母细胞瘤患者单核细胞和巨噬细胞的t-SNE图。b、 代表性免疫组织荧光（IHF）图像显示MPO和IBA1（一种巨噬细胞标记物）在胶质母细胞瘤中共定位。c、 来自三个公开数据集的MPO+与MPO-巨噬细胞中富集途径的摄入途径分析。d、 HIF1α表达投射到胶质母细胞瘤患者单核细胞和巨噬细胞的t-SNE图。e、 胶质母细胞瘤样品中每1mm2核心的细胞数。f、 每1个细胞邻域中细胞数。g、 对于MPO+M1样MDM数量为零、低或高的患者，通过对单个图像的双侧排列测试（每个1000个排列）进行成对交互。h、 基于MPO+IBA1+细胞频率的Kaplan–Meier分析。

研究者使用IMC技术提供了脑肿瘤TME的高维空间图。研究者对胶质母细胞瘤和BrM中的细胞动力学、相互作用和邻域进行了全面分析，并将胶质母细胞细胞瘤的空间特征与患者生存率相关联。研究者发现了一个独特的中性粒细胞样巨噬细胞亚群（MPO染色阳性），这似乎有利于胶质母细胞瘤患者的生存。考虑到脑肿瘤患者的治疗选择有限，预后不佳，脑TME的空间结构与肿瘤生物学的关系、利用特定免疫细胞亚群来改善预后，具有潜在的转化价值。

参考文献：Karimi, E., Yu, M.W., Maritan, S.M. et al. Single-cell spatial immune landscapes of primary and metastatic brain tumours. Nature614, 555–563 （2023）. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05680-3

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撰稿：赵传，盖菁菁

审校：张俊平

排版：郜志孟